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(ELISA)酶联免疫吸附实验
发布时间:2016-11-03   点击次数:548次

(ELISA)酶联免疫吸附实验

一、实验目的:
酶联免疫吸附试验是免疫酶技术的一种,免疫酶技术属于三大标
记技术之一,掌握该试验的原理和主要技术,了解三大标记技术的异同及各自的主要应用。

二、实验原理:
酶联免疫吸附试验(ELISA)是应用酶标记的抗体(或抗原)在固相支持物表面检测未知抗原(或抗体)的方法。酶与抗体(或抗原)交联后,再与集合结合在固相支持物表面的相应抗原或抗体反应,形成酶标记抗体-抗原复合物,此时加入酶底物和显色剂,在酶催化底物液体后呈现显色反应,液体显色的强弱和酶标记抗体-抗原复合物的量成正比,借此反映出待检测的抗原或抗体量。

酶联免疫吸附试验是利用抗原-抗体的免疫学反应和酶的催化底物反应的特点,具有生物放大作用,所以反应灵敏,可检出浓度在ng水平。在免疫反应部分,抗原-抗体的亲和力、抗原和半抗原的性质、测定方法的实验条件、酶标记物的性质等因素影响反应的敏感性。在酶学反应部分,酶的浓度、底物的浓度、反应pH和温度、酶的抑制剂和激活剂等因素液影响反应的敏感性。

酶联免疫吸附试验中所使用的试剂都比较稳定,按照一定的实验程序进行测定实验结果重复性较好,有较高的准确性。酶联免疫吸附法成本低,操作简便,可同时快速测定多个样品,不需要特殊的仪器设备。ELISA法测定技术与其他技术结合发展成为专门的分析方法,如与电泳技术结合的免疫印迹技术,与层析技术结合的层析-ELISA技术等已成为生物实验室的常规技术。

三、试剂与器材:
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 48, 96孔)。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液::0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, 4℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液:同稀释液
7. 封闭液:0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液(底物):临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液:2mol/LH2SO4。

四、操作方法:
1.包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16~18小时。
2. 洗涤:倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,zui后将反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升,37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清:用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物:邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液:每孔50微升。
11. 观察结果:用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

五、关键步骤与注意事项:
1、酶标记抗体以及待检样本的使用浓度应事先滴定
2、保存的血清切忌反复冻融,以免降低血清中抗体或抗原的免疫学活性。
3、酶-底物反应时间除人为规定(常规规定为30分钟)外,还可以阳性参考标本的OD值达到1.0时为反应终点。
4、底物液一定要在临用前现配。

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