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细胞培养实验技术大全
发布时间:2017-06-06   点击次数:1051次

细胞培养实验技术大全

*章 细胞培养的基本原理与技术
现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术,而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系,特别是在医药领域的发展,细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养,杂交瘤单克隆抗体,完全是通过细胞培养来实现的,既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现,发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之,细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
*节 体外培养的概念
一、基本概念 体外培养(in vitro culture),就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出,放在类似于体内生存环境的体外环境中,让其生长和发育的方法。
组织培养:是指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法。
细胞培养:是指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。
器官培养:是指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化
1、差异:细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中,日久天长,易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此,培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后,这种差异就开始发生了。
2、分化:体外培养的细胞分化能力并未完全丧失,只是环境的改变,细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件,如Friend细胞(小鼠红白血病细胞)在一定的因素作用下可以合成血红蛋白,血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构,杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体,这些均属于细胞分化行为。
第二节 细胞培养的一般过程
一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试。
二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理。
三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基。如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
原代培养一般有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。
四、冻存及复苏(可参阅后面有关章节)为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,zui终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
五、常用仪器设备 无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具,CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。
第三节 细胞培养的无菌环境
一、无菌室
无菌室的结构:一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。
无菌室的消毒和防污染:为保持无菌状态,经常消毒是必要的,通常采用每日(使用前)紫外照射(1-2小时),每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸(2小时)和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中,要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。
此外,还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括:送入无菌室的风没有被过滤除菌;进出无菌室时,能使外界空气直接对流进无菌室的操作间;等。
二、超净工作台
工作原理:鼓风机驱动空气通过过滤器得以净化,净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走,使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同,可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。
超净台的使用与保养:超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜,过大、过小均不利于保持净化度;使用前开启超净台内紫外灯照射10-30分钟,然后让超净台预工作10-15分钟,以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态;使用完毕后,要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净,以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。
第四节 常用培养器皿及清洗消毒
细胞培养需要大量消耗性物品,如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等,因此掌握清洗、消毒知识,学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。
一、清洗 离体条件下,有害物质直接同细胞接触,细胞对任何有害物质十分敏感,极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此,新的或重新使用的器皿都必须认真清洗,达到不含任何残留物的要求。
(一)玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。
1、浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡,软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗,然后用5%盐酸浸泡过夜;用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂,干涸后不易刷洗掉,故用后应立即浸入清水中备刷洗。
2、刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中,用软毛刷反复刷洗。不要留死角,并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干,备浸酸。
3、浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中,又称酸液,通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时,一般过夜或更长。放取器皿要小心。
4、冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗,浸酸后器皿是否冲洗的干净,直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿,每件器皿至少要反复“注水-倒空”15次以上,zui后用重蒸水浸洗2-3次,晾干或烘干后包装备用。
(二)橡胶制品清洗
新的橡胶制品洗涤方法:0.5mol/L NaOH煮沸15分钟,流水冲洗,0.5mol/L HCl煮沸15分钟,流水冲洗,自来水煮沸2次,蒸馏水煮沸20分钟,50℃烤干备用。
(三)塑料制品的清洗
塑料制品特点:质软、易出现划痕;耐腐蚀能力强、但不耐热。
清洗程序:使用器皿后立即用清水清洗,浸于自来水过夜,用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗,流水冲洗,晾干,浸于清洁液15分钟,流水冲洗(15-20遍),蒸馏水浸洗三次,双蒸水泡24小时,晾干备用。
(四)包装:对细胞培养用品进行消毒前,要进行严密包装,以便于消毒和贮存。常用的包装材料:牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等,近几年用铝箔包装,非常方便,适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内,较大的器皿可以进行局部包扎。
二、消毒和灭菌 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因
(一)物理消毒法
1、紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射,可杀死多种微生物。革兰阴性菌zui为敏感,其次是阳性菌,再次为芽孢,真菌孢子的抵抗力zui强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活,间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒,用法简单,效果好。
紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关,辐射强度随灯距离增加而降低,照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间,每天照射2-3小时,期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间,2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米,照射时间30分钟为宜。
紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害,且对培养细胞与试剂等也产生不良影响,因此,不要开着紫外等操作。
2、高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是zui常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力,能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。
不同压力蒸汽所达到的温度不同,不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品(不包括液体),应立即放到60-70℃烤箱内烘干,再贮存备用,否则,潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法,它具有条件简单、使用方便等特点。
3、高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上,并保持90-120分钟,杀死细菌和芽孢,达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿(如体积较大的烧杯、培养瓶)、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品(如粉剂、油剂)。
干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开,切忌立即打开,以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙,物品不要靠近加热装置。
烧灼也是灭菌方法之一,常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。
4、过滤除菌:是将液体或气体用微孔薄膜过滤,使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留,从而达到除菌目的。在体外培养时,过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前,大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
(二)化学消毒:新洁而灭,其0.1%水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。
(三)抗生素消毒:抗生素主要用于消毒培养液,是培养过程中预防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同,应根据需要选择。
可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多,但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气;多用新洁而灭消毒实验室地面;常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿;采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。
第二章 细胞培养液
现代生物技术均通过细胞作为载体来进行,无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基,即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质,就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境,使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有:水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。
随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展,作为细胞培养领域中zui基本的原料-细胞培养基的用量也迅速增加,被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域,如疫苗生产(人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等,兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等),基因药物生产(如EPO、TPA等),临床用单抗(如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3)等。
*节 水与平衡盐溶液
1、培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感,对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质,即使含量极微,有时也会影响细胞的存活和生长,甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水,可能会含有某些金属离子,一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。用龙头瓶贮存,存放时间一般不应超过2周。
2、缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液:稍后介绍。
第二节 细胞培养基的基本要求
体外培养的细胞直接生活在培养基中,因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。
一、营养成分 维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面:
1、氨基酸:是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺,它在细胞代谢过程中有重要作用,所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源,同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。 体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。
2、单糖:培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解,六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力zui高,半乳糖zui低。
体外培养动物细胞时,几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。
3、维生素:主要扮演辅酶、辅基的角色,必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。
4、无机离子与微量元素:细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素,还需要微量元素,如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
二、促生长因子及激素 已证实:各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态(分化或未分化)具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用,如胰岛素,它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用,如可促进表皮细胞的生长,泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。
三、渗透压 细胞必须生活在等渗环境中,大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞,渗透压在260-320mOsm/kg的范围都适宜。
四、pH 气体也是细胞生存的必需条件之一,所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环,产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下,借糖酵解也可获取能量,但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时,一般置细胞于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞所需成分,它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件,pH值约在7.2~7.4℃在细胞生长过程中,随细胞数量的增多和代谢活动的加强,二氧化碳不断被释放,培养液变酸,PH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳,很不稳定,致使缓冲系统难以地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用,可提供更有效的缓冲体系,主要是防止pH值迅速变动,但zui大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。造成pH波动主要是代谢产生的CO2 ,在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸,培养基pH很快下降。为解决这一问题,合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统,并采用开放培养,使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶,再通过稳定调节温箱中CO2 浓度(5%),与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。
五、无毒、无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力,因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病毒等)、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(如抗体、补体)。对于天然培养基,污染主要来源于取材过程及生物材料本身,应当严格选材,严格操作。对于合成培养基,污染主要来源于配制过程,配制所用的水,器皿应十分洁净,配制后应严格过滤除菌。
第三节 天然细胞培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
一、血清(serum)细胞培养的发展,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是zui为广泛的,所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。
1、血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中用量zui大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质zui高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分zui少。
2、血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展,但仍存在一些问题。主要是:
*:血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难;
第二:血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制;
第三:不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。
3、血清主要作用:
提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。
提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。
4、细胞培养中使用血清的缺点
血清成分复杂,虽含许多对细胞有利成分,也含有对细胞有害的成分,使血清有几个明显的缺点:
对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。
血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。
动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致。
取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性。
血清的使用使得实验和生产的标准化困难,其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。
大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。
5、血清的质量标准:血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:
牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。
血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。
无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。
对细胞有良好的支持繁殖作用。
我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。
血清质量的鉴定一般包括以下几个方面:
理化性质:如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量(不低于35-45g/L)、球蛋白含量(应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标,血清中球蛋白主要是抗体,球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。
微生物检测:包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测,支原体是一种很小的微生物,可通过孔径22u的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉,细胞也能生长繁殖,但会影响实验结果。检测支原体的方法很多,如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。
促生长效果:这是血清重要的特性之一,应当以培养的细胞来检测。有两种方法:克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。
(1)克隆形成率测定:一般以悬浮生长的细胞为培养对象,按有限稀释法做克隆化培养,将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基,细胞也稀释成不同浓度,接种到96孔板,每孔200ul,培养一定时间,统计有克隆生长的孔,计算出百分比,再与对照的标准血清相比较,就可看出不同批号血清间的区别。比较低的浓度,更能观察出血清质量间的细微差别。
(2)贴瓶率测定:是以贴壁细胞为培养对象,将细胞稀释至低密度,接种至平皿,每皿200或100个细胞,以不同浓度的血清培养基培养,培养一定时间后弃培养基,染色后统计集落数,计算出集落数占接种细胞数的百分比,同样再与标准血清比较,判断血清质量高低。
(3)连续传代培养法:是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中,待测血清配制为5%浓度,一般于第七天收集细胞,计数,取平均值,中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以上,观察细胞生长状况,并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。
对于使用者,判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮,土黄色或棕黄色,无沉淀或极少沉淀,比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀物,说明血清污染或血清中的蛋白质变性;若血清呈棕红色,说明血清中的血红蛋白含量太高,取材时有溶血现象;如果摇晃时感觉液体稀薄,说明血清中掺入的生理盐水太多。如果要进一步了解血清的质量,则应连续培养某些细胞,观察细胞生长状况。
6、血清的使用与储存:正确的使用及保存血清,才能使血清发挥应有的作用。
使用前处理:大部分血清在使用前必须灭活处理,即56℃30分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分,避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分,如生长因子,因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养,这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。
储存条件:血清一般储存于-20℃,同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后,首先要灭活处理,然后分装成小包装,储存于-20℃,使用前融化。融化时现置于4℃。融化后的血清在4℃不宜长时间存放,应尽快使用。
使用浓度:自从有了合成培养基,血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用,使用浓度一般为5-20%,zui常用是10%。过多血清容易使培养中的细胞发生变化,特别是一些二倍体的无限细胞系,迅速生长之后容易发生恶性转化。 采购血清时,先从供应商处索取样品进行试验,选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量,直至用另一批经过预先试验的样品代替。
二、胚胎浸出液
胚胎浸出液(embryonic extract)是早期动物细胞培养中应用的天然培养基,现已很少使用。
三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物,含有丰富的氨基酸,是常用的天然培养基,可用于许多细胞和原代细胞的培养。
第四节 合成细胞培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方,是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种,有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养是利用天然培养基,目前合成培养基已经成为一种标准化的商品,从zui初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基,并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。
一、基本组分 基本培养基包括四大类物质:无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
无机盐:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。
氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料,不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外,还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用,对细胞的培养特别重要,能促进各种氨基酸进入细胞膜;它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源,还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是:谷氨酰胺在溶液中很不稳定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中单独配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培养液中。
维生素:是维持细胞生长的一种生物活性物质,在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶,对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。维生素C也是不可缺少的,对具有合成胶原能力的细胞更为重要。
碳水化合物:是细胞生命的能量来源,有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时,几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。
葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用:乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明,体外培养条件下95%的葡萄糖转变为乳酸,这降低了营养物质的代谢效率,降低培养基pH值,增加渗透压。在氧气供给不足的情况下,NADH转运系统苹果酸-天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+,细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+,从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下,直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此体外培养条件下,葡萄糖主要经糖酵解降解,产生过量的乳酸。减少乳酸生产zui常用的方法是限制培养基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足,细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑方可应用。
在目前常用的培养基中,葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源,其能量代谢通路与体内完全不同,表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量,谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径,另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此,适当的调整细胞内的代谢途径,使之能促进细胞的快速生长和产物合成,同时减少代谢抑制物的生成是行之有效的一种策略。
许多动物细胞如CHO、BHK和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言,二者的快速利用并非细胞必需;相反相当一部分转化为代谢废物乳酸和氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中,乳酸和氨是两种主要代谢废物,其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两种代谢产物的积累,是大规模细胞培养技术研究的重要方向。
氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生成的常用方法。
除了以上与细胞生长有关的物质以外,培养基中一般还要加入酚红(当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色;当溶液碱性时pH大于8.4呈红色),一种pH指示剂。
在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A。
二、常用细胞培养基
(1)MEM细胞培养基系列
(2)DMEM细胞培养基系列
(3)RPMI-1640细胞培养基系列
(4)199细胞培养基系列
(5)水解乳蛋白细胞培养基
(6)欧氏平衡盐
(7)F-10,F-12细胞培养基系列
(8)其它类型细胞培养基
三、干粉培养基的配制
配制培养基要注意以下问题:
认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。
配制是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。
配制所用的水应是三蒸水,离子浓度很低。
所用器皿应严格消毒。
配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于4度。
液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基,它是一种灭菌后保证无菌的溶液,必要时可制成无内毒素等的溶液,可节省科研人员的工作量。
配制方法
在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5%的双蒸水。
在室温(20℃到30℃)的水中加入干粉培养基,轻轻搅拌,不要加热。
水洗包装袋的内部,转移全部的痕量干粉到容器内。
加NaHCO3到培养基中。
用双蒸水稀释到想要的体积,搅拌溶解。注意不要过分搅拌。
通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值,由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3,因而调节pH值使它比zui终想要的pH值低0.2到0.3。培养基在过滤前要保持密封。
第五节 无血清技术及其培养基
经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本,简化分离纯化步骤,避免病毒污染造成的危害。
无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求,但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规模的培养某种细胞,以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的多种无血清培养基,可满足众多厂商的需求。
一、无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。
用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时,多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。
添加组分包括以下几大类物质:
(1)促贴壁物质:许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子,对许多细胞的繁殖和分化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
(2)促生长因子及激素:针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素是许多细胞必不可少的,如胰岛素。
(3)酶抑制剂:培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂,以终止酶的消化作用,达到保护细胞的目的。zui常用的是大豆胰酶;抑制剂。
(4)结合蛋白和转运蛋白:常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素:硒是zui常见的。
二、使用方法:目前,血清仍是动物细胞培养中zui基本的的添加物,尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时,常常会先使用有血清的培养液进行培养,待细胞生长旺盛以后,再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程,一般要逐步降低血清浓度,从10%减少到5%,3%,1%,直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化,是否有部分细胞死亡,存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留,很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前,要留有种子细胞,种子细胞按常规培养于含血清的培养基中,以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养,关键的是使所培养细胞:
处于对数生长中期>90% 活细胞率
适应时以较高的起始细胞接种
有两种方法使细胞适应无血清培养基(SFM):
1、直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应,接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时,传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时,细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天,当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2、连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中,与直接适应相比较,连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基:25%SFM 混合培养基中,传代培养。
当细胞密度>5×105细胞/ml时,以2×105到3×105细胞/ml细胞密度,在有血清培养基:SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
以2×106到3×106细胞/ml细胞密度,25%有血清培养基和75% SFM中传代培养。
当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml(接种后4到6天),在100%SFM培养基中传代培养。
每隔3到5天,当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml,细胞活率在90%时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物,直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中,不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意,与有血清培养基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白质,因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清:许多细胞利用连续适应方法能很好的适应,用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1(v∶v)的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式,连续几代减少当前培养基的量:1∶2,1∶4,1∶16和100%替代培养基。每次适应改变血清比例时,传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清,生长的延迟可能会发生,4允许进行2到3次的传代,使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是:配制无血清培养液必须使用高质量的水,如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子,既便水中的有毒物质含量甚微,也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。
三、使用无血清培养基的优点
增加确定性
性能更加一致
容易进行纯化和下游加工
细胞功能的评估
增强生长和/或产量
生理反应性的较好对照
增强细胞内中介物的检测
第六节 无蛋白培养基与限定化学成分培养基
一、无蛋白培养基(protein free midium,PFM):即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白,如胰岛素,转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看,不含动物蛋白的培养基又广泛的应用前景,许多利用基因工程技术重组的蛋白质zui终要应用于人体,如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基,纯化过程就比较复杂,zui终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的,许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。
二、限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM):是指培养基中的素有成分都是明确的,它同样不含有动物蛋白,同样也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世,上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM。
第七节 其他细胞培养用液
在细胞培养过程中,除了培养基外,还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。
一、平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS):主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。zui简单的BSS是Ringer。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+,因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3(2.2g/L),适合于5%CO2 的培养条件,Hank's平衡液仅含有0.35g/L NaHCO3,不能用于5%CO2的环境,若放入CO2培养相,溶液将迅速变酸,使用时应注意。
配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+,应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。
二、消化液:取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液,传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来,常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,有时也用胶原酶(collagenase)溶液。
1、胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常见有1:125和1:250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度,配制时要用不含Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡盐溶液(如前面的D-Hank's),因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的zui佳pH是8-9,配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右,充分溶解,过滤除菌。过滤后可以再调只pH7.5,也可不调。
使用细胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的细胞清洗液(100ml细胞清洗液加0.5g胰酶),过滤除菌,分装于4度保存。
2、EDTA溶液:EDTA溶液也常用来解离细胞,它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞,还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%,配制时应加碱助溶,配制后可过滤除菌,也可高温消毒灭菌。
3、胶原酶溶液:胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,胶原酶作用的对象是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的zui佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+ 、Mg2+及血清的抑制,配制时可用PBS。
三、pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1、NaHCO3溶液:NaHCO3是培养基中必须添加的成分,一般情况下按说明书的要求准确添加,以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养,即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡,所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液调节培养基,使之达到所要求的pH环境。
2、HEPES溶液:是一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,对细胞无毒性,主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境,CO2 气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。
四、抗生素:常用的是青链霉素,俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度0.01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液,可用PBS或培养基配制。
五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50%,所以都是在使用前添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L(29.22g/L),配制时应加温30℃,完全溶解后过滤除菌,分装至小瓶,储存于-20℃。使用时,在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1~4mmol/L。
六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)
在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分;而L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸,在中性的水溶液中会自发降解;需要频繁地补加L-谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常:
(1)频繁打开盖子,增加了破坏无菌状态的可能性;
(2)过多的追加L-谷氨酰胺,增加了培养基中氨的毒性水平。
二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨zui少!
二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,产生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸;因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同样有效地被利用。二肽谷氨酰胺是zui优替代物,它无需适应;既可用于贴壁细胞培养,也适合于悬浮细胞的培养。
第三章 细胞培养的基本方法
*节 培养细胞的细胞生物学
一、基本概念通常,体外培养的生物成分无外乎两种结构形式:
其一是小块组织或称为组织块(tissue block),一般称为外植块;
其二是将生物组织分散后制成的单个细胞,一般称为分离的细胞(isolated cell)或者分散的细胞(dissociated cell)。
分散的过程通常在培养液或平衡盐溶液中进行,分散的细胞被悬浮于培养液或平衡盐溶液中。
单个细胞分散存在于培养液或其它平衡盐溶液中、缓冲溶液中,就称为细胞悬液(cell suspension)。
狭义的细胞培养(cell culture)主要是指分离(散)细胞培养,广义的细胞培养的概念还包括单(个)细胞培养(single cell culture)。一种是群体培养(mass culture),将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层;另一种是克隆培养(clonal culture),将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中,各个细胞贴壁后,彼此距离较远,经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落,称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
现今,用于疫苗生产的细胞基本有3类,即原代细胞、二倍体细胞株及传代细胞系。经过几十年的研究和发展,目前我国已经拥有了可以进行大规模疫苗生产的动物原代细胞、二倍体细胞和Vero细胞等生产技术,用于生产多种人用、动物疫苗。其中二倍体细胞(如我国70年代建立的人胚肺二倍体细胞株KMB17和2BS)对多种病毒具有广泛的敏感性,用其制备病毒性疫苗可以克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险,是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质。Vero细胞是1962年由日本Chiba大学的Yasumura等人从成年非洲绿猴肾中分离获得的,是一种贴壁依赖性成纤维细胞,核型为2n 60,高倍体率约为1.7%,可持续地进行培养,不含任何污染因子。通常使用199培养基添加5%胎牛血清进行培养。该细胞可用于多种病毒的增殖,已被WHO批准广泛用于人用、动物用疫苗生产。
二、体外培养细胞的分型
(一)贴附型:大多数培养细胞贴附生长,属于贴壁依赖性细胞,大致分成以下四型:
1、成纤维细胞型:胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间充质起源的组织,如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
2、上皮型细胞:细胞呈扁平不规则多角形,中央有圆形核,细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动,处于膜边缘的细胞总与膜相连,很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
3、游走细胞型:呈散在生长,一般不连成片,胞质常突起,呈活跃游走或变形运动,方向不规则。此型细胞不稳定,有时难以和其他细胞相区别。
4、多型细胞型:有一些细胞,如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态,可统归于此类。
(二)悬浮型:见于少数特殊的细胞,如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形,不贴于支持物上,呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。
三、培养细胞的生长和增殖过程:体内细胞生长在动态平衡环境中,而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器,生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后,则需要分离出一部分细胞和更新营养液,否则将影响细胞的继续生存,这一过程叫传代(Passage或Subculture)。每次传代以后,细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外,很多细胞在体外的生存也不是无限的,存在着一个发展过程。所有这一切,使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。
(一)培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells):所谓培养细胞生命期,是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。人胚二倍体成纤维细胞培养,在不冻存和反复传代条件下,可传30~50代,相当于150~300个细胞增殖周期,能维待一年左右的生存时间,zui后衰老凋亡(Apoptosis)。如供体为成体或衰老个体,则生存时间较短;如培养的为其它细胞,如肝细胞或肾细胞,生存时间更短,仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变,如获永生性或恶性转化时,细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时,不论细胞的种类和供体的年龄如何,在细胞全生存过程中,大致都经历以下三个阶段:
1、原代培养(Primary Culture)期:也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到*次传代阶段,一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的(Heterogeneous),也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。
2、传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持续时间zui长。在培养条件较好情况下,细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型,呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系(Diploid Cell Line)。为保持二倍体细胞性质,细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存,则需反复传代以维持细胞的适宜密度,以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10~50次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第三期。
3、衰退期:此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强,zui后衰退凋亡。
在细胞生命期阶段,少数情况下,在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期),由于某种因素的影响,细胞可能发生自发转化(Spontaneous Transformation)。转化的标志之一是细胞可能获得永生性(Immortality)或恶性性(Malignancy)。细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite Cell Line),也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。无限细胞系的形成主要发生在第二期末,或第三期初阶段。细胞获不死性后,核型大多变成异倍体(Heteroploid)。细胞转化亦可用人工方法诱发,转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。
(二)组织培养细胞一代生存期 所有体外培养细胞,包括初代培养及各种细胞系,当生长达到一定密度后,都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下,细胞数量增加与饱和速度相对要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比时要快)。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。
所谓细胞“一代”一词,系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间,这已成为培养工作中的一种习惯说法,它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞,即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代(Generation)或倍增〔Doubling〕不同;在细胞一代中,细胞能倍增3~6次。
细胞传一代后,一般要经过以下三个阶段:
1、潜伏期(Latent Phase):细胞接种培养后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上,称贴壁,悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同,这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢,可长达10~24小时或更多;连续细胞系和恶性细胞系快,10~30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附;底物表面不洁不利贴附,底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中,有一些特殊物质如纤维连接素(Fibronectin),又称LETS(Larger External Transformation Substance),细胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分,它们有的存在于细胞膜的表面(如CSP),有的则来自培养基中的血清(LETS)。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。
细胞贴附于支持物后,除先经过前述延展过程变成极性细胞,还要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长,约24~96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅6~24小时;细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入指数增生期。
2、指数增生期(Logarithmic growth Phase):这是细胞增值zui旺盛的阶段,细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%~0.5%,初代细胞分裂指数低,连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%~5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力的时期,因此是进行各种实验的和zui主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3~5天后,随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、zui后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后,如培养的是正常细胞,由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动,这种现象称接触抑制(Contact Inhibition)。而恶性细胞则无接触抑制现象,因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(Piled up)。细胞接触汇合成片后,虽发生接触抑制,只要营养充分,细胞仍然能够进行增殖分裂,因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养的枯竭和代谢物的影响,则发生密度抑制(Density Inhibition),导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念,不应混淆。
3、停滞期(Stagnate Phase):细胞数量达饱和密度后,细胞遂停止增殖,进入停滞期。此时细胞数量不再增加,故也称平顶期(Plateau)。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代,否则细胞会中毒,发生形态改变,重则从底物脱落死亡,故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下,虽进行了传代,因细胞已受损,需要恢复,至少还要再传1~2两代,通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后,才能再用。结果反而耽误了时间,这是在实验中应特别注意的。
四、原代培养:即*次培养,是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养,中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义:
培养物一经接种到培养器皿(瓶)中就不在分割,任其生长繁殖;
原代培养中的“代”并非细胞的“代”数,因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞;
原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液,也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限,只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了,细胞的生长就会出现停滞,大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去,这些存活的细胞一般能够传到40~50代,这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。当细胞株传至50代以后又会出现“危机”,不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变,并且带有癌变的特点,有可能在培养条件下无限制地传代下去,这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系(株)必经的阶段,其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小,对病毒敏感性好,因此适应制备疫苗等生物制品;但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤,在所有的操作过程中,都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下,分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞,就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层,这种培养方式称为单层细胞培养(monolayer culture),又叫贴壁培养(adherent culture)。少数情况下,培养的细胞没有贴壁依赖性,可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长,这种形式称为悬浮培养(suspension culture)。如何让接种的细胞尽快贴壁,是决定培养成功的关键步骤:
取决于适当的生长基质表面;
可降低接种后培养液对细胞的浮力,如先少补加少量培养液,待细胞贴壁后再补足营养液继续培养;
注意适当的细胞接种密度,一般105个/ml左右。
五、传代培养:当原代培养成功以后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养。这个过程就称为传代(passage)或者再培养(subculture)。对单层培养而言,80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养,可以相对地衡量培养物的培养年龄。
六、生长曲线:细胞接种入培养瓶后,先进入2-24h的延迟期(lag period),然后进入指数生长期(即对数期)(log phase),汇合成单层进入缓慢生长或停滞期(即平台期)(plateau lhase)。每种细胞系(cell line)的这些生长期(growth phase)都是特征性的,只要环境条件保持恒定,每一次测定结果应该是可重复的。
第二节 细胞分离技术
一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离(散)成细胞悬液的方法有多种,zui常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短,以保持zui大的活性。下列步骤可以解聚整个组织,获得较高产量的有活性细胞。
1、胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的组织后,使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片,通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀,去除上清液。重复清洗2到3次。
将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100mg组织加入1ml 胰蛋白酶)。
在4℃孵育6到18小时,使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
移弃组织碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
在组织碎片加入热的完全培养基,用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基,要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过无菌不锈钢丝网(100~200mm)过滤,分散所有剩余组织。计数和接种细胞,进行培养。
2、胶原酶 (Collagenase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗组织碎片几次。
加入胶原酶(50~200单位/ml,溶解在HBSS中)。
在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的胶原酶。
通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。
3、Dispase
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片,用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。加入Dispase(0.6~2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液)在37℃孵育20分钟到几个小时。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的Dispase。通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。
二、从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞,且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用,每一种系统zui佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。再次培养时检测细胞的活性。细胞的活率应该超过90%对于无血清培养基,降低胰蛋白酶使用量。
1、移弃使用过的细胞培养基。
2、使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗细胞(看表确定正确的清洗溶液)。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液,通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层,然后去除清洗液。
3、以2~3ml/25cm2的量,加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶,轻轻摇动培养瓶。通常,在5到15分钟内,细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程,避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系,可以轻轻敲打,以加速分离过程。
4、当细胞完全分离时,垂直放置培养瓶,让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基,通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。
5、对于无血清培养基,加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。
第三节 细胞的冻存与复苏
为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑,考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异,有时因寄赠、交换和购买,培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室,zui佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(-70℃~-196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内,水晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。
一、细胞的冻存:为避免污染造成的损失,zui小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化,需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前,细胞应该特性化并检查是否污染。
有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基,成分可能如下:
包含10%甘油的完全培养基,
包含10%二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基,
50% 细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基,或
50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基,一些普通的培养基成分可能是:
50% 细胞条件无血清培养基和50%包含有7.5%二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基,或
包含有7.5%二甲基亚砜和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
1、悬浮细胞
计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200~400g离心5分钟沉淀细胞,使用移液管移去上清到zui小体积,不要搅乱细胞。
以1×107到5×107细胞/ml密度,在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞,或者以0.5×107到1×1027在无血清培养基中,再次悬浮细胞。
分装进冻存管,将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。
2、贴壁细胞
使用分离试剂从基层分离细胞,分离时尽可能温和,使对细胞的损伤减少到zui小。
在完全生长培养基中,再次悬浮分离细胞,确定有活力细胞数。
以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到zui小体积,不要搅乱细胞。
以5×106到1×106细胞/ml密度,在冻存液中悬浮细胞。
分装进冻存管,将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中,5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻,可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后转移到液氮中贮存。
二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱,要轻柔操作。冻存细胞要快速融化,并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感,离心去除冻存培养基,然后加入完全生长培养基中。
1、直接铺板方法
取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数,细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。培养细胞12到24小时,更换新鲜的完全生长培养基,去除冻存剂。
2、离心方法
取出贮存细胞,37℃水浴中快速融化。
把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基,轻轻混匀。
以大约80x g离心2到3分钟。
弃去上清。
在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞,并且进行活细胞计数。
细胞铺板,细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。
三、细胞的分化、衰老与死亡
1、细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个,可以区分为200多种不同类型的细胞:形态结构,代谢,行为,功能等各不相同。追根溯源,这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以,通常把发育过程中,细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段,也发生在胎儿出生以后,乃至成人阶段。例如,人体血细胞的产生和分化,这个过程在人的一生中一直持续着。
由旺盛生长不断分裂的细胞,转入分化,通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞,它们的基因表达和代谢活动各不相同。
2、细胞的衰老:体外细胞培养实验证明:
成纤维细胞:来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14--28次后衰老死亡,来自乌龟传代90--125次后衰老死亡。
细胞衰老过程中会发生一系列的变化,包括:蛋白质合成速度降低,已有蛋白质结构变化,特异蛋白质成份出现;同时,细胞核,线粒体,膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。
细胞衰老原因,尚无定论,出现过好几种理论与假说,其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。
3、细胞凋亡:细胞的死亡是个体存活的正常现象,常见的细胞死亡形式有3种:坏死、凋亡和细胞毒性。多细胞生物的生命活动中,因为环境因素的突然变化或病原物的入侵,导致一部分细胞,称为细胞的病理死亡,或细胞坏死。坏死是细胞暴露于严重的物理或化学刺激时导致的细胞死亡;细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件,不依赖于其它两种细胞死亡机理,如杀伤T细胞的细胞毒性作用。
还有一种情况,一部分细胞的死亡是生物个体正常生命活动(代谢、生长、发育、分化)的一个必要部分;似乎带有“牺牲局部,保全整体”的意味。这种情况下的细胞死亡,明显地受遗传控制,称为细胞凋亡。 凋亡(Apoptosis)则是程序性的、正常的细胞死亡,是机体清除无用的或者不想要的细胞的手段。它与细胞坏死是两个截然不同的过程,无论从形态学、生物学还是生化的特征来说,都有明显的区别。细胞凋亡现象普遍存在于生物界。细胞凋亡与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用,在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色。作为细胞的一种基本生命现象,凋亡失控的结果将是可怕的:凋亡不足时,易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病;而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(HIV)、重症肝炎与退行性神经疾病,如老年性痴呆症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)。因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义。
细胞凋亡与坏死的区别
坏死 :
形态学特征-膜完整性丧失,胞浆和线粒体膨胀,全细胞裂解。
生化特征-离子内环境失调:非能量依赖性的(被动过程,在4°C也可以发生),随机消化DNA(电泳显示为DNA弥散状态),Postlytic DNA断裂。
生理学特征-影响群组细胞:由非生理学因素引起(如补体攻击、代谢中毒、缺氧等),被巨噬细胞吞噬,周围有明显的炎症反应。
凋亡 :
形态学特征-胞膜出芽,但保持完整,染色体聚集在核膜周边,胞浆收缩、细胞核凝集,zui后细胞分裂为凋亡小体,Bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加。
生化特征--ATP依赖性的(主动过程,在4°C不能发生),以核小体为单位剪切DNA(电泳显示为DNA ladder),Prelytic DNA 断裂,线粒体释放多种因子至胞浆中(细胞色素c、AIF),Caspases级联活化,膜对称性改变(PS外翻)
生理学特征--只影响单个细胞,由生理学刺激诱导(如生长因子缺乏、激素环境改变等),被临近细胞和巨噬细胞吞噬,无炎症反应。
第四节 细胞计数及活力测定
一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品:普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)
2、试剂:0.4%台盼兰,0.5%四甲基偶氮唑盐(MTT)、酸化异丙醇
3、材料:细胞悬液
三、操作步骤
(一)细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:
细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000
注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
(二)细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟。
3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
(三)MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。
l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟,弃上清液。
2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成悬液。
3、37℃下保温2小时。
4、加入4—5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。
5、1000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色,酸化异丙醇调零点。
注意:MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞数。
第五节 细胞的分裂指数
一、原理:体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力,可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的,如随着分裂指数的不断提高,细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比,它是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品:CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管
2、试剂:培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液
三、操作步骤
1、消化细胞,将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。
2、CO2培养箱中培养48小时,使细胞长在盖片上。
3、取出盖片,按下列顺序操作:
PBS漂洗3分钟→甲醇:冰醋酸=3:1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。
4、盖片晾干后反扣在载玻片上,镜检。
5、计算:
分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%
四、注意事项;操作时动作要轻,以免使盖片上的细胞脱落。
第六节 细胞周期的测定
一、原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。
BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器、用品:同常规细胞培养
2、试剂:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液
三、操作步骤
1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使zui终浓度为10μg/ml。
2、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
4、常规染色体制片(见第三部分:染色体技术)。
5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。
6、弃去2×SSC液,流水冲洗。
7、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。
8、镜检100个分裂相,计*、二、三、四细胞期分裂指数。
9、计算:
细胞周期(Tc)=48/(小时)
第七节 培养物的污染及防止
按现代的观念,凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。根据这一概念,组织培养污染物应包括生物(真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质(影响细胞生存、非细胞所需的化学成分)、细胞(非同种的其他细胞)。其中一微生物zui为多见。另外,随着使用细胞种类增多,不同细胞交叉污染,尤其是Hela细胞的污染也时有发生,从而造成细胞不纯。
一、污染途径 污染物,特别是微生物常通过下列途径进入培养体系,造成污染
1、空气:空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性大,如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分,外界不洁空气很容易进入造成污染。因此,培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行,工作时要带口罩,以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面,造成污染。
2、器材:各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染,另外需要对培养箱进行定期消毒,防止形成污染
3、操作:实验操作无菌观念不强,技术不熟练,使用污染的器皿或封瓶不严等,都可以造成污染。培养两种细胞以上时,操作不规范,交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。
4、血清:有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染,变成了污染。
5、组织样本:原代培养的污染多数来源于组织样本;取材时碘酒消毒后脱碘不彻底,可造成碘混入组织,细胞或培养液中,影响细胞细胞生长。
二、污染对培养细胞的影响及污染的检测
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力,而且培养基中的抗生素抗污染能力有限,因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时,如果能及时去除污染物,部分细胞有可能恢复、但是当污染物持续存在培养环境中,轻者细胞生长缓慢,分类象减少,细胞变得粗糙,轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重,细胞增值停止,分裂象消失,细胞质中出现大量堆积物,细胞变圆、脱壁。
(一)细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测
常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用, 其繁殖处于抑制状态,细胞生长不受明显影响,污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时,取10ml细胞悬液离心1000转5分钟,沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。
如果培养无真的细菌污染,24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时,大约每20分钟一代,会使培养系统中很快产生大量细菌,后者不仅可以消耗培养系统中的养分,还能释放大量代谢产物。几个小时后,增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊,肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH,使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察,可见满视野都是点状的细菌颗粒,原来的清晰培养背景变得模糊,大量的细菌甚至可以覆盖细胞,对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。
(二)真菌污染对细胞的影响及污染物的检测
微生物污染中以真菌zui多,真菌种类繁多,形态各异,但是污染后易于发现,大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面,肉眼可见;有的散在生长,镜下可见呈丝状、管状、树枝状,纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形,散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速,能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。
(三)支原体污染对细胞影响及污染物的检测
细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养zui常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉,有些污染的细胞仍在被应用。研究表明,95%以上是以下四种:口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii),为牛源性。以上是zui常见的污染细胞培养的支原体菌群,但能够污染细胞的支原体种类是很多的,国外调查证明,大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查,目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。
污染来源包括工作环境污染、操作者本身污染(一些支原体在人体是正常菌群)、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染后,因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊,细胞无明显变化,外观上给人以正常感觉,实则细胞手到多方面潜在影响,如引起细胞变形,影响DNA合成,抑制细胞生长等。
细胞培养中,主要从以下几个方面来预防支原体的污染:控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要清除支原体,常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体zui突出的结构特征是没有细胞壁,一般来讲,对作用于细胞壁生物合成的抗生素,如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体zui有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮;其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用,所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。
(四)细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测
细胞培养中,细胞间交叉污染并不罕见,多是由于在培养中操作时各种细胞同时进行,混杂使用器皿和液体所致,这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化,有些变化较轻、不易察觉,有些可能由于污染的细胞具有生长优势zui终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制,zui终死亡。常用观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。
三、污染的预防:防止污染,预防是关键,预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终。
1、器皿准备中的预防:用于细胞培养的器皿应该严格消毒,做到真.

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