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如何解决血清抗原的阴性对照偏高的问题?
发布时间:2017-04-11   点击次数:303次

如何解决血清抗原的阴性对照偏高的问题?

做的间接ELISA,用猪血清作为包被抗原,兔抗体作为一抗,HRP-羊抗兔作为二抗。阳性的反应基本正常,而且抗体效价不错。可就是阴性对照老是很高,使用小牛血清封闭好想基本没有效果(我试过用pH7.4 的pbs和pH9.6 的cbs 稀释1%、5%、10%浓度的小牛血清,另外还有明胶)。以下是我昨天做的一个结果,一抗从1:12800稀释(阴性阳性均同),抗原从1.25ug/ml开始包被,都是倍比稀释。
1  2  3  4  5  6
3.027  3.046  3.008  2.765  2.242  1.686
0.586  0.457  0.436  0.399  0.478  0.567
3.486  2.922  2.171  1.518  1.153  0.808
0.523  0.461  0.527  0.638  0.590  0.582
2.355  2.019  1.413  1.272  0.912  0.859
0.466  0.474  0.543  0.612  0.526  0.566
1.283  1.307  1.035  0.636  0.798  0.525
0.646  0.911  0.666  0.542  0.463  0.496
其中红色标记的是阴性对照的od值。
目前已排除的影响od可能性因素:
1.抗原与二抗的交叉反应;
2.二抗自身的非特异性吸附;
3.阴性血清的质量(新鲜采集的未免疫兔血清)
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上述结果与用其他封闭液的结果或不用封闭液的结果十分相似,大约都稳定在0.5左右,偶尔有偏高的。使用抗原或抗体的进一步稀释都不能解决这个问题。请问有没有那个做过用血清作为抗原的间接ELISA实验,阴性本底是怎么降低的,用什么封闭剂效果较好?

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