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人类外周血染色体制备
发布时间:2017-05-09   点击次数:466次

人类外周血染色体制备

一、原理
人外周血小淋巴细胞,通常都处在G1期(或G0期),一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素(PHA),这种小淋巴细胞受到刺激
可转化为淋巴母细胞,进入有丝分裂。短期培养后,经秋水仙素处理,低渗和固定,即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有
约1×106~3×106个小淋巴细胞,足够染色体标本制备和分析之用。
二、用品和试剂
1.5ml注射器(7号针尖),培养瓶、刻度吸管,需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片,经洗液按常规清洗、烘干备用。
2.超净工作台,恒温培养箱,天平,离心机、显微镜等。
3.试剂:
(1)RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液,并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。
(2)肝素钠(肝素):称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,15磅20分钟灭菌。
(3)秋水仙碱(秋水仙素〕,生理盐水配制成10μg/ml浓度,15磅20分钟灭菌,分装,置-20℃。
(4)低渗液:0.35%KCl。
(5)固定液(Carnoy固定液) 甲醇∶冰乙酸(3∶l),临时配制。
(6)Giemsa工作液:1份原液和10份磷酸缓冲液,临时配制。
(7)磷酸缓冲液:1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。
(8)5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。
三、操作步骤
(一)细胞培养
1.培养基的配制:
在超净工作台中,100ml培养基含以下成分和比例:
RPMI-1640 84ml
小牛血清 15ml
PHA 3支
肝素钠 1ml
卡那霉素 终浓度为100单位/ml
以5% NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2-7.4。
用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶),4℃备用。
2.采血:酒精消毒皮肤,肘静脉采血0.3—0.5ml,立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞,向10ml培养基中注入30—40滴全血,轻摇匀后置
37℃恒温箱培养。
3.培养:时间为68小时。培养期间,定期轻摇匀,使细胞充分接触培养基。
4.秋水仙素处理:终止培养前2—4小时,在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴,使终浓度为0.07μg/ml)。
以上步骤均需无菌操作
(二)染色体制备
1.收集细胞:将培养物全部转入洁净离心管中,以1000rpm离心8—10分钟,弃上清液。
2.低渗处理:向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml,用滴管混匀,置37℃恒温水浴中低渗15—25分钟。
3.预固定:低渗后加入0.5ml固定液,轻轻混匀后1000rpm离心8—10分钟。
4.一固定:弃上清液,加入5ml固定液,轻轻混匀,静置20分钟。1000rpm离心,弃上清液。
5.二固定、三固定:同一固定。
6.制悬液:弃上清液后,视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7.滴片:吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上,轻吹散,气干。
8.染色:1:10 Giemsa染色5—10分钟,细水洗去多余染液,气干。
9.镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,油镜下观察染色体形态并计数。
四、注意事项
l.培养温度应严格控制在37±0.5℃,培养液zui适合pH为7.2—7.4。
2.秋水仙素处理时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
3.低渗使红细胞膜破裂,淋巴细胞膨胀,低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻,否则引起膜破裂、染色体散失。
4.离心前配平,离心速度过高,细胞团不易打散;反之,细胞易丢失。
5.固定液应在使用前临时配制。
6.载玻片一定要洁净,否则染色体分散不好。

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