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肝星状细胞实验步骤
发布时间:2017-06-22   点击次数:315次

肝星状细胞实验步骤

实验步骤如下
小鼠3%戊巴比妥钠腹腔麻醉。
以“U”型切口打开腹腔。将肠管推向腹腔左侧,暴露门静脉及下腔静脉
剪一小口,将充满灌流液的针头经小口插入门静脉,止血夹夹住
打开恒流泵的开关开始灌流,并迅速剪断下腔静脉。肝脏在灌注开始几秒内变成黄白色(灌注结束的时候,肝脏上可见白色纹理)。
灌流结束,将肝脏移至培养皿中,加入少量(5ml左右)solutionII,显微镜下尽量去除胆管和血管,剪碎肝组织
将搅碎的肝组织倒入50 ml的离心管,加入solutionII至30ml,加入胶原酶,pronase和DNase,37度水浴消化12 min。(如果前面的灌注不好的话,可以适当延长消化时间)
消化结束的时候能够看到部分未消化完的肝组织。
加入15ml血清终止反应。70μm过滤网过滤。
20G,4min离心,去除肝细胞(因为肝细胞重,所以会低速离心也能够沉下去)
收集悬浮液,450G,7min使悬浮液中的细胞都沉下去。吸掉悬浮液,加入15%optiprep,充分吹打,在其上轻轻加入5ml11.5%optiprep和5mlGBSS
1400G,17min 离心。
GBSS和11.5%optiprep间能够看到浅白色的条带
轻轻收集中间GBSS和11.5%optiprep间层5ml,加入5mlGBSS 450G,8min离心。吸掉悬浮液,加入适当的DMEM培养液,计数,培养
 

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